Effects of hypoxic preconditioned on expression of MMP-2 and Cx43 in hypothermic hypoxia-reoxygenation cardiomyocytes
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摘要:背景
再灌注心律失常(reperfusion arrhythmia，RA)是体外循环心内直视手术中心肌缺血再灌注损伤较为常见的并发症，探索其发生机制对预防RA有重要意义。
目的研究低氧预处理H9C2细胞条件培养基对低温缺氧-复氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)心肌细胞的保护作用，为预防和减少RA的发生提供实验支持。
方法将H9C2细胞随机分为5组，分别为阴性对照组(C组，以等体积含10%胎牛血清的DMEM培养基培养正常心肌细胞)、低氧组(H组，低氧条件培养基培养低温H/R心肌细胞)、常氧组(N组，常氧条件培养基培养低温H/R心肌细胞)、重组蛋白基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)组(MMP-2组，200 ng/mL重组蛋白MMP-2培养基培养低温H/R心肌细胞)和MMP-2抑制剂组(ARP-100组，0.03 mol/L ARP-100培养基培养低温H/R心肌细胞)。CCK-8法检测心肌细胞活力；Hoechst33342染色及流式细胞术Annexin V/PI双染检测心肌细胞凋亡率；划痕标记染料示踪技术检测缝隙连接通讯；明胶酶谱法检测细胞培养液中MMP-2活性；Western blot检测MMP-2、缝隙连接蛋白43 (connexin 43，Cx43)和磷酸化Cx43 (p-Cx43)蛋白表达；免疫荧光检测心肌细胞膜上Cx43表达。
结果与C组相比，N组心肌细胞活力降低(P＜0.01)，凋亡增加(P＜0.01)，缝隙连接通讯减弱，MMP-2表达上调(P＜0.01)，Cx43和p-Cx43表达均下调(P＜0.01)，心肌细胞膜上Cx43荧光强度减弱(P＜0.05)。与N组相比，H组心肌细胞活力升高(P＜0.01)，凋亡减少(P＜0.01)，缝隙连接通讯增强，MMP-2活性降低(P＜0.05)，MMP-2表达下调(P＜0.01)，Cx43和p-Cx43表达均上调(P＜0.01)，心肌细胞膜上Cx43荧光强度增强(P＜0.05)。与MMP-2组相比，H组和ARP-100组心肌细胞Cx43及p-Cx43表达均上调(P＜0.01)，心肌细胞膜上Cx43荧光强度增强(P＜0.01)，缝隙连接通讯增强。
结论低氧预处理H9C2细胞条件培养基通过抑制MMP-2活性介导上调Cx43和p-Cx43表达，从而改善低温H/R心肌细胞间缝隙连接通讯，减少心肌细胞凋亡，提高心肌细胞活性。
Abstract:BackgroundReperfusion arrhythmia (RA) is a relatively common complication of myocardial ischaemia-reperfusion injury during extracorporeal circulation endocardial direct vision surgery, and it is of great significance to explore the pathogenesis of RA.
ObjectiveTo investigate the protective effect of hypoxic preconditioned H9C2 cell conditioned medium on hypothermic hypoxia-reoxygenation H9C2 cardiomyocytes, so as to provide experimental support for the reduction of RA.
MethodsH9C2 cells were randomly divided into five groups, negative control group (equal volume of DMEM medium containing 10% fetal bovine serum cultured normal cardiomyocytes, Group C), hypoxia group (hypoxic conditioned medium cultured with hypothermic H/R cardiomyocytes, Group H), normoxia group (normoxic conditioned medium cultured with hypothermic H/R cardiomyocytes, Group N), recombinant protein MMP-2 group (200 ng/mL recombinant protein MMP-2 medium cultured with hypothermic H/R cardiomyocytes, MMP-2 group), and MMP-2 inhibitor group (0.03 mol/L ARP-100 medium cultured with hypothermic H/R cardiomyocytes, ARP-100 group). Cardiomyocyte viability was detected by CCK8 assay; cardiomyocyte apoptosis rate was detected by Hoechst33342 staining and Annexin V/PI double staining by flow cytometry; gap junction intercellular communication was detected by scrape-loading dye transfer technique; MMP-2 activity was detected by gelatin zymography in the cell culture medium; MMP-2, Cx43 and p-Cx43 protein expression were detected by Western blot; and the expression of Cx43 on the cardiomyocyte membranes was detected by immunofluorescence.
ResultsCompared with the group C, cardiomyocyte viability in the N group was decreased (P<0.01), apoptosis was increased (P<0.01), gap junction intercellular communication was attenuated, MMP-2 expression was upregulated (P<0.01), while both Cx43 and p-Cx43 expression were downregulated (P<0.01), and Cx43 fluorescence intensity was attenuated on cardiomyocyte membranes (P<0.05). Compared with the N group, cardiomyocyte viability in the H group was elevated (P<0.01), apoptosis was reduced (P<0.01), gap junction intercellular communicatio was enhanced, MMP-2 activity was decreased (P<0.05), MMP-2 expression was downregulated (P<0.01), both Cx43 and p-Cx43 expression were upregulated (P<0.01), and Cx43 fluorescence intensity was enhanced on cardiomyocyte membranes (P<0.05). Compared with the MMP-2 group, cardiomyocytes Cx43 and p-Cx43 expression in the H group and ARP-100 group were upregulated (P<0.01), Cx43 fluorescence intensity on the cardiomyocyte membranes was enhanced (P<0.01), with enhanced gap junction intercellular communication.
ConclusionHypoxia preconditioned H9C2 cell conditioned medium improves gap junction intercellular communication between hypothermic H/R cardiomyocytes, reduces cardiomyocyte apoptosis, and enhances cardiomyocyte activity through inhibition of MMP-2 activity-mediated upregulation of Cx43 and p-Cx43 expression.
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再灌注心律失常(reperfusion arrhythmia，RA)是心肌缺血再灌注损伤的主要表现[1]。低氧预处理(hypoxic preconditioning，HPC)是近年来针对低温缺血再灌注损伤的治疗手段之一，可以触发和调动细胞的内在自我保护能力，减轻后续各种病理损伤的程度[2-3]。低氧处理的条件培养基可以保护心肌细胞免受应激损伤[4]。相关研究证实HPC不仅可以保护心肌细胞免受缺氧-复氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)损伤，还可增强细胞耐受性并促进细胞合成许多细胞因子[5-6]。本课题组前期研究表明，RA的发生与心肌细胞缝隙连接蛋白43 (connexin 43，Cx43) 表达下调有关，具体机制尚不明确[7-8]。相关研究证实缺血再灌注期间基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)的释放会导致心脏收缩功能障碍[9]。但目前关于RA与MMP-2活性之间关系的研究尚不充分。在以往研究基础上，本研究选取H9C2心肌细胞为实验对象，探讨低氧预处理的H9C2心肌细胞在提高自身活力的基础上能否分泌更多具有保护作用的细胞因子，以条件培养基途径来产生对低温缺氧-复氧心肌细胞的保护作用，并探索其作用机制是否与MMP-2和Cx43的表达有关。
1. 材料与方法
1.1 主要材料
H9C2细胞(大鼠心肌细胞；赛百慷生物技术股份有限公司，中国)，DMEM培养基、胰蛋白酶和胎牛血清(Gibco公司，美国)，RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，中国)，荧光黄(Sigma公司，美国)，Hoechst33342染色液(Solarbio公司，中国)，兔单抗Cx43、兔单抗磷酸化Cx43 (p-Cx43)和羊抗兔二抗(Abcam公司，美国)，MMP-2一抗(万类生物科技公司，中国)，MMP-2二抗(三鹰生物技术有限公司，中国)，GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗免IgG (武汉普美克生物技术有限公司，中国)，胶原蛋白酶2, 9检测试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司，中国)，ARP-100 (APExBIO公司，美国)，MMP-2重组蛋白(MCE公司，美国)。
1.2 H9C2细胞培养
于37℃、5% CO2培养箱中，含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素完全培养基培养H9C2细胞。待细胞密度达90%以上，用0.25%胰酶消化传代，24 h后换液，取第3 ~ 6代对数生长细胞用于实验。
1.3 实验分组及H9C2细胞条件培养基的制备
将H9C2细胞随机分为5组，分别为阴性对照组(C组)、低氧组(H组)、常氧组(N组)、重组蛋白MMP-2组(MMP-2组)和MMP-2抑制剂组(ARP-100组)。待H9C2细胞正常培养融合至80%，吸弃原培养基，PBS清洗2次，更换新的含10%胎牛血清的DMEM培养基，随机将H9C2细胞置于常氧培养箱(21% O2，5% CO2)和低氧培养箱(1% O2，5% CO2)中，低氧10 min、复氧30 min，共3个循环。24 h后收集两种细胞上清液，分为常氧条件培养基和低氧条件培养基，4℃下离心5 min，0.45 μm滤器过滤去除死细胞和细胞碎片等杂质。N组：常氧条件培养基培养低温H/R心肌细胞；H组：低氧条件培养基培养低温H/R心肌细胞；MMP-2组向低氧条件培养基中加入200 ng/mL重组蛋白MMP-2以激活MMP-2活性，再培养低温H/R心肌细胞；ARP-100组向低氧条件培养基中加入0.03 mol/L ARP-100以阻断MMP-2活性，再培养低温H/R心肌细胞；C组以等体积含10%胎牛血清的DMEM培养基培养正常心肌细胞。
1.4 H9C2心肌细胞低温缺氧-复氧模型制备
H9C2心肌细胞置于缺氧装置中，以5 L/min的速度持续吹入95% N2 + 5% CO2 15 min进行缺氧处理，于4℃冰箱中进行低温处理1 h；处理完成后，于37℃、5% CO2培养箱中复氧4 h。
1.5 光镜下观察H9C2心肌细胞形态
将处理结束后的H9C2心肌细胞放置于显微镜下观察，观察C组、H组和N组的心肌细胞数量、分布、排列和形态。
1.6 CCK-8法检测H9C2心肌细胞活力
将H9C2心肌细胞以3 × 103/孔的细胞密度接种于96孔板，每组3个复孔，处理结束后，按CCK-8试剂盒检测流程，检测C组、H组和N组H9C2心肌细胞吸光度值，采用酶标仪在450 nm处读取吸光度值。细胞活力=(实验组吸光度值－空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值) × 100%，空白组只加培养液、不加细胞。
1.7 Hoechst33342染色检测H9C2心肌细胞凋亡形态学变化
将H9C2心肌细胞以2.5 × 105/孔的细胞密度接种于6孔板，处理结束后，在C组、H组和N组H9C2心肌细胞中加入适量Hoechst33342染色液(1 mL/孔)，在培养箱中培养20 ~ 30 min。弃染色液用PBS洗涤2 ~ 3遍，最后放置于荧光显微镜下观察。
1.8 流式细胞术Annexin V/PI双染检测H9C2心肌细胞凋亡率
处理结束后，用1 mL无EDTA 0.25%胰酶将H9C2心肌细胞消化收集于流式管中，离心5 min；加入3 mL PBS重悬细胞，4℃下离心5 min；加入200 μL的结合缓冲液重悬；5 μL Annexin V-FITC混匀后，再加入5 μL碘化丙啶混匀；室温下避光反应15 min。于1 h内上机检测C组、H组和N组H9C2心肌细胞凋亡率。用FlowJo软件分析细胞不同状态(主要为早期凋亡、晚期凋亡和死亡)比例和数目。
1.9 划痕标记染料示踪技术检测H9C2心肌细胞缝隙连接通讯
将H9C2心肌细胞以2.5 × 105/孔的细胞密度接种于6孔板。处理结束后，吸弃培养皿中原培养基，加入3 mL PBS清洗3次，再加入0.1%荧光黄染料2 mL，用手术刀在皿底部轻划3条后置于培养箱中孵育5 min，用PBS清洗5 ~ 6次之后再用4% PFA固定20 min，最后放置荧光显微镜下观察5组H9C2心肌细胞荧光黄扩散范围。
1.10 明胶酶谱法检测MMP-2活性
将N组和H组细胞培养液使用分光光度计定量后，按照1∶1稀释于2 × SDS-PAGE非还原型缓冲液，20 mA恒流低电流电泳，溴酚蓝染色剂跑至凝胶底部时切断电源，室温加入10 mL 1 × 缓冲液A洗涤凝胶18 h，弃掉缓冲液A。加入10 mL 1 × 缓冲液B，室温孵育过夜，倒掉缓冲液B后加入考马斯亮蓝工作液以覆盖凝胶，快速振荡2 h，使用脱色液(甲醇∶冰醋酸∶水=5∶7∶88)清洗2次，每次2 h；置于扫描仪上扫描。
1.11 Western blot法检测MMP-2、Cx43和磷酸化Cx43 (p-Cx43)的相对表达量
处理结束后，收集5组H9C2心肌细胞，每组3个复孔，离心后加入适量裂解液裂解细胞，使用BCA试剂盒测定样品蛋白浓度，蛋白样品经SDS-PAGE电泳分离后，转移至PVDF膜。封闭液封闭PVDF膜1 h后，加入MMP-2一抗(1∶1 000)或兔抗鼠Cx43一抗(1∶1 000)或p-Cx43一抗(1∶1 000)或GAPDH (1∶6 000)，4℃孵育过夜。TBST洗膜后加入羊抗兔二抗(1∶5 000)室温孵育30 min。电化学发光显影，采集图像Image J软件处理并分析蛋白条带的灰度值。并以GAPDH条带灰度值为对照计算MMP-2、Cx43和p-Cx43相对表达量。
1.12 免疫荧光检测心肌细胞膜上Cx43表达量
制备H9C2心肌细胞爬片，处理结束后，将爬片用PBS浸洗3次，4%多聚甲醛固定爬片15 min。在爬片上滴加山羊血清，室温封闭1 h。滴加Cx43一抗并放入湿盒中4℃孵育过夜。加荧光二抗，放入湿盒中20 ~ 37℃孵育1 h，PBST浸洗爬片3次。复染核：滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行染核，PBST洗去多余的DAPI。用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，在荧光显微镜下观察5组H9C2心肌细胞膜上Cx43相对荧光强度。
1.13 统计学分析
使用Graphpad Prism 8.0软件进行统计学分析，正态分布计量资料以
$\bar x \pm s $ 表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 低氧预处理H9C2细胞条件培养基对低温H/R心肌细胞活力、凋亡的影响
与C组相比，N组心肌细胞形态皱缩，数量减少；与N组相比，H组心肌细胞形态为梭形，数量增加。与C组相比，N组心肌细胞相对吸光度值降低(P＜0.01)；与N组相比，H组心肌细胞相对吸光度值升高(P＜0.01)。Hoechst33342染色及流式细胞术Annexin V/PI双染检测结果显示，与C组相比，N组心肌细胞凋亡率增加(P＜0.01)；核固缩且胞核呈亮蓝光。与N组相比，H组心肌细胞凋亡率降低(P＜0.01)；核固缩细胞减少。见图1。
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图 1 各组H9C2心肌细胞形态、相对吸光度值及心肌细胞凋亡的情况A：光镜(40 × )下及经Hoechst33342染色(10 × )后荧光显微镜下H9C2心肌细胞形态的比较；B：H9C2心肌细胞相对吸光度值统计；C：流式细胞术检测H9C2心肌细胞的凋亡情况；D：H9C2心肌细胞凋亡率统计。Figure 1. H9C2 cardiomyocytes morphology，relative absorbance values and cardiomyocyte apoptosis in each group2.2 低氧预处理H9C2细胞条件培养基对低温H/R心肌细胞Cx43蛋白表达及缝隙连接通讯的影响
免疫印迹实验结果显示，与C组相比，N组Cx43蛋白表达下降(P＜0.01)，p-Cx43蛋白表达降低(P＜0.01)。与N组相比，H组Cx43蛋白表达升高(P＜0.01)，p-Cx43蛋白表达升高(P＜0.01)。免疫荧光检测结果显示，与C组相比，N组心肌细胞膜上Cx43荧光强度减弱(P＜0.05)。与N组相比，H组心肌细胞膜上Cx43荧光强度增强(P＜0.05)。划痕标记染料示踪技术检测结果显示，C组荧光黄沿划痕处向两边扩散，扩散距离较远；而N组荧光黄扩散范围显著减少，与N组相比，H组心肌细胞荧光黄扩散范围又有所增加。见图2。
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图 2 各组H9C2心肌细胞Cx43、p-Cx43蛋白表达情况及划痕标记染料示踪结果A：H9C2心肌细胞Cx43及p-Cx43 Western blot实验电泳图；B：H9C2心肌细胞Cx43、p-Cx43蛋白表达水平统计；C：H9C2心肌细胞膜上Cx43相对荧光强度统计；D：免疫荧光检测H9C2心肌细胞膜上Cx43荧光强度表达(10 × )；E：划痕标记染料示踪结果(10 × )。Figure 2. Results of Cx43，p-Cx43 protein expression and scrape-loading and dye transfer of H9C2 cardiomyocytes in each group2.3 低氧预处理H9C2细胞条件培养基可减弱低温H/R心肌细胞来源的MMP-2活性
明胶酶谱法检测结果显示，与N组相比，H组低温H/R心肌细胞培养液中MMP-2活性降低(P＜0.05)。与C组相比，N组MMP-2蛋白表达升高(P＜0.01)。与N组相比，H组MMP-2蛋白表达降低(P＜0.01)。见图3。
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图 3 各组H9C2心肌细胞来源的MMP-2检测结果A：明胶酶谱法检测MMP-2活性及统计；B：H9C2心肌细胞MMP-2 Western blot 实验电泳图及蛋白表达水平统计。Figure 3. Results of H9C2 cardiomyocyte-derived MMP-2 in each group2.4 低氧预处理H9C2细胞条件培养基可通过抑制MMP-2活性介导上调Cx43蛋白表达及其磷酸化水平，改善低温H/R心肌细胞间缝隙连接通讯
免疫印迹实验结果显示，与MMP-2组相比，H组和ARP-100组Cx43蛋白表达升高(P＜0.01)，p-Cx43蛋白表达升高(P＜0.01)。免疫荧光检测结果显示，与MMP-2组相比，H组和ARP-100组心肌细胞膜上Cx43荧光强度增强(P＜0.01)。划痕标记染料示踪技术检测结果显示，与MMP-2组相比，H组和ARP-100组心肌细胞荧光黄扩散范围增加。见图4。
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图 4 各组H9C2心肌细胞Cx43、p-Cx43蛋白表达情况及划痕标记染料示踪结果A：H9C2心肌细胞Cx43及p-Cx43 Western blot 实验电泳图；B：H9C2心肌细胞Cx43、p-Cx43蛋白表达水平统计；C：心肌细胞膜上Cx43相对荧光强度统计；D：免疫荧光检测心肌细胞膜上Cx43荧光强度表达(10 × )；E：划痕标记染料示踪结果(10 × )。Figure 4. Results of Cx43，p-Cx43 protein expression and scrape-loading and dye transfer of H9C2 cardiomyocytes in each group3. 讨论
再灌注心律失常是体外循环心脏外科手术过程中心脏恢复自动节律性时最常见的并发症之一。虽采取了低温心肌保护措施，但长时间RA无疑会加剧心肌损伤，严重者可影响血流动力学稳定性、体外循环转机时间、手术成败及患者预后[10]。因此，如何改善RA的发生，是目前研究的热点。研究表明，低氧预处理条件培养基可改善心肌细胞H/R损伤、抑制心肌细胞凋亡[4,11]。因此，低氧预处理H9C2细胞条件培养基对低温H/R心肌细胞活力和凋亡的影响，是本实验首要预探究的问题。本研究建立心肌细胞低温H/R模型，探究此种HPC的H9C2细胞能否在提高自身存活率的基础上，以其条件培养基为媒介通过旁分泌方式发挥对低温H/R心肌细胞活力和凋亡的保护作用。本研究初步实验结果显示，与常氧条件下获得的条件培养基相比，HPC的条件培养基培养低温H/R心肌细胞后，心肌细胞相对吸光度值增加、心肌细胞凋亡减少。提示低氧预处理H9C2细胞条件培养基可提高低温H/R心肌细胞活性，减少低温H/R心肌细胞凋亡。验证了HPC条件培养基可减少心肌细胞低温H/R损伤，抑制心肌细胞凋亡。
缝隙连接(gap junction，GJ)是细胞间通讯的关键通道，使电信号在心脏中有序传播[12]。GJ是由缝隙连接蛋白构成，是细胞间电活动传递的主要物质基础[13]。其中Cx43是心肌细胞中广泛存在的一种连接蛋白，主要介导心肌细胞间的代谢偶联与电偶联作用[14-15]。Cx43的磷酸化水平在维持心肌细胞正常生理活动中也扮演着重要作用，是细胞间偶联和传导降低的主要因素[16]。本课题组前期研究发现RA的发生与Cx43表达下调及其磷酸化水平、心电传导功能降低有关，但具体机制尚不清楚[7-8]。近来研究表明，心肌细胞衍生的外泌体通过细胞之间穿梭的核酸、蛋白质和脂质介导细胞间信号传导和通讯，有利于心肌细胞修复，发挥对心肌的保护作用[17-19]。在低氧条件下心肌细胞应激诱导转录因子上调，通过细胞外分泌促进心脏成纤维细胞的激活[20]。因此，本研究使用HPC后的条件培养基来培养低温H/R心肌细胞，观察低氧预处理H9C2心肌细胞是否通过其细胞外分泌的方式发挥对低温H/R心肌细胞间缝隙连接通讯的保护作用。研究结果显示，经HPC的条件培养基培养低温H/R心肌细胞后，Cx43和p-Cx43蛋白表达水平均上调、心肌细胞膜上Cx43荧光强度增强、心肌细胞间缝隙连接通讯增强。提示低氧预处理H9C2细胞可能通过旁分泌方式释放化学介质到条件培养基中发挥对低温H/R后心肌细胞活力、凋亡、缝隙连接通讯的保护作用，其机制可能与Cx43和p-Cx43蛋白表达上调有关。
基质金属蛋白酶是一类锌依赖性内肽酶，可降解细胞外基质中各种蛋白质底物，包括胶原蛋白和弹性蛋白[21-22]。MMP-2和MMP-9在催化结构域中插入3种类似Ⅱ型纤维连接素，以降解明胶和Ⅳ型胶原蛋白，通过MMP-2和MMP-9作用产生的胶原蛋白Ⅰα1已被证明可以直接与心脏成纤维细胞结合，诱导细胞迁移，同时减少胶原蛋白分泌[23-25]。心肌损伤后MMP-9表达上调可能会导致N-钙黏蛋白的直接水解，而N-钙黏蛋白的心脏特异性损失可导致Cx43减少。本课题组前期研究表明RA的发生与 MMP-9上调介导Cx43表达下调有关，但目前关于RA与MMP-2之间关系的研究尚不充分[26]。文献报道，MMP-2活性下调可抑制弹性蛋白降解，增加内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)生物利用度来减轻冠状动脉硬化[27]。MMP-2在大部分心脏细胞类型中表达和分泌，因其低效信号序列可能导致合成后有部分留于心肌细胞，当心脏I/R时过氧亚硝酸盐增多导致MMP2激活，激活后的MMP-2会切割许多细胞内靶点，第1个被识别的是肌钙蛋白Ⅰ，从而导致心脏收缩功能障碍[28]。而体外低温H/R处理可很好地模拟I/R这一过程。因此，猜测HPC条件培养基对低温H/R心肌细胞缝隙连接通讯的保护作用机制可能与低温H/R心肌细胞所分泌的MMP-2有关。
研究表明，免疫印迹可以从蛋白质水平量化某种MMPs的表达，但MMPs的高表达并不代表高活性[29-30]。而明胶酶谱造影可检测到细胞外分泌的MMP-2和MMP-9高活性[31]。因此本研究使用明胶酶谱造影检测MMP-2活性，结果显示，低温H/R心肌细胞培养液中MMP-2高活性，而相比低温H/R心肌细胞培养液，HPC后低温H/R心肌细胞培养液中MMP-2活性有所降低。这也证实了上述假设，即低氧预处理H9C2细胞条件培养基可减弱低温H/R心肌细胞来源的MMP-2活性。根据免疫印迹结果显示，低温H/R心肌细胞MMP-2表达上调，而HPC条件培养基培养低温H/R后心肌细胞MMP-2表达下调，提示低氧预处理H9C2细胞条件培养基对低温H/R心肌细胞活力、凋亡、缝隙连接通讯保护作用机制可能与MMP-2下调有关。但对于MMP-2与Cx43蛋白表达及其磷酸化水平之间的关系尚不清楚。因此，本研究使用重组蛋白MMP-2和ARP-100，以激活/阻断MMP-2活性，验证激活/抑制MMP-2活性是影响Cx43蛋白表达及其磷酸化水平重要因素。根据免疫印迹实验、免疫荧光检测和划痕标记染料示踪技术结果显示，与加入重组蛋白MMP-2的培养基相比，低氧预处理和加入ARP-100的培养基培养低温H/R心肌细胞后，心肌细胞Cx43蛋白表达及其磷酸化水平上调，心肌细胞膜上Cx43荧光强度增加，心肌细胞间缝隙连接通讯增强。因此，证实了低氧预处理可通过抑制MMP-2活性介导上调Cx43蛋白表达，发挥对低温H/R心肌细胞间缝隙连接通讯的保护作用。
本研究存在一些局限性。虽然初步发现低氧预处理H9C2细胞条件培养基对低温H/R心肌细胞活力、凋亡、缝隙连接通讯的保护作用，以及其保护作用机制可能与通过抑制MMP-2活性介导上调Cx43蛋白表达有关，但对其培养液中可能存在的其他介质需要进一步提取和分析鉴定。我们课题组下一步将重点探讨培养液中存在的其他化学介质以及具体的上下游信号通路，为探索临床上防治RA的潜在干预手段提供一定依据。
综上所述，经低氧预处理后的H9C2细胞条件培养基可改善低温H/R心肌细胞间缝隙连接通讯，抑制心肌细胞凋亡，提高心肌细胞活性，其机制可能与通过抑制MMP-2活性介导上调Cx43和p-Cx43的表达有关。
作者贡献 严旭：实验实施，总体构思，撰写初稿；高鸿、柏雪、安丽、吴学艳：监督指导，审读和修订；胡廷菊、陈锐、宋雨婷：文献的搜集和处理。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突。
数据共享声明 本论文相关数据可依据合理理由从作者处获取，Email：15718523307@163.com。
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图 1 各组H9C2心肌细胞形态、相对吸光度值及心肌细胞凋亡的情况
A：光镜(40 × )下及经Hoechst33342染色(10 × )后荧光显微镜下H9C2心肌细胞形态的比较；B：H9C2心肌细胞相对吸光度值统计；C：流式细胞术检测H9C2心肌细胞的凋亡情况；D：H9C2心肌细胞凋亡率统计。
Figure 1. H9C2 cardiomyocytes morphology，relative absorbance values and cardiomyocyte apoptosis in each group
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图 2 各组H9C2心肌细胞Cx43、p-Cx43蛋白表达情况及划痕标记染料示踪结果
A：H9C2心肌细胞Cx43及p-Cx43 Western blot实验电泳图；B：H9C2心肌细胞Cx43、p-Cx43蛋白表达水平统计；C：H9C2心肌细胞膜上Cx43相对荧光强度统计；D：免疫荧光检测H9C2心肌细胞膜上Cx43荧光强度表达(10 × )；E：划痕标记染料示踪结果(10 × )。
Figure 2. Results of Cx43，p-Cx43 protein expression and scrape-loading and dye transfer of H9C2 cardiomyocytes in each group
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图 3 各组H9C2心肌细胞来源的MMP-2检测结果
A：明胶酶谱法检测MMP-2活性及统计；B：H9C2心肌细胞MMP-2 Western blot 实验电泳图及蛋白表达水平统计。
Figure 3. Results of H9C2 cardiomyocyte-derived MMP-2 in each group
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图 4 各组H9C2心肌细胞Cx43、p-Cx43蛋白表达情况及划痕标记染料示踪结果
A：H9C2心肌细胞Cx43及p-Cx43 Western blot 实验电泳图；B：H9C2心肌细胞Cx43、p-Cx43蛋白表达水平统计；C：心肌细胞膜上Cx43相对荧光强度统计；D：免疫荧光检测心肌细胞膜上Cx43荧光强度表达(10 × )；E：划痕标记染料示踪结果(10 × )。
Figure 4. Results of Cx43，p-Cx43 protein expression and scrape-loading and dye transfer of H9C2 cardiomyocytes in each group
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