Role of tumor-associated macrophage exosomes in regulating proliferation, migration and invasion of laryngeal carcinoma cells
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摘要:背景
肿瘤相关巨噬细胞外泌体通过传递信号分子调控肿瘤细胞的生物学行为，但在喉癌的研究中鲜有报道。
目的探讨肿瘤相关巨噬细胞外泌体对喉癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。
方法使用生物信息学方法分析头颈鳞癌与肿瘤相关巨噬细胞的关系；诱导并鉴定M0和M2型肿瘤相关巨噬细胞，采用RT-qPCR、Western blot实验对其表达的细胞表面标志物IL-10、Arginase-1 (Arg-1)、CCL-18、CD206、CD-163进行检测；提取并鉴定M0和M2型巨噬细胞分泌的外泌体(M0-exo和M2-exo)，采用透射电镜法观察外泌体特有结构，纳米颗粒追踪法测定外泌体粒径，Western blot实验检测其表达的标志性蛋白HSP70；将人喉癌细胞(AMC-HN-8)分为M0-exo组和M2-exo组，其中M0-exo组为实验组，M2-exo组为对照组。采用CCK-8实验和细胞克隆形成实验检验M0-exo和M2-exo对细胞增殖能力的影响，细胞划痕实验检验M0-exo和M2-exo对单层细胞运动能力的影响，Transwell实验检验M0-exo和M2-exo在3D环境中对细胞运动能力的影响，Western blot实验检测N-钙黏蛋白、波形蛋白、E-钙黏蛋白以验证M2-exo是否对喉癌细胞的上皮间质转化进程产生影响，进而影响细胞的迁移、侵袭能力。
结果根据生物信息学分析，发现头颈鳞癌中巨噬细胞富集情况明显；分析其中免疫细胞的组成情况，发现M2型巨噬细胞占13%；培养成功的M2型巨噬细胞表达其特有的细胞表面标志物。M2-exo符合外泌体的结构和生物学特征。与M0-exo组相比，M2-exo组AMC-HN-8细胞的增殖、迁移、侵袭能力增强，差异均有统计学意义(P＜0.05)。
结论M2型肿瘤相关巨噬细胞外泌体可促进喉癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。
Abstract:BackgroundTumor-associated macrophage (TAM) exosomes regulate the biological behavior of tumor cells by transferring certain signaling molecules. These biovesicles have been extensively studied in breast cancer and colorectal cancer, but there is limited research on their role in laryngeal cancer.
ObjectiveTo investigate the effects of TAM exosomes on the proliferation, migration, and invasion capacity of laryngeal cancer cells.
MethodsBioinformatics analysis was employed to explore the relationship between head and neck squamous cell carcinoma and TAMs, M0 and M2 TAMs were induced and characterized using RT-qPCR and Western blotting. The exosomes secreted by M0 and M2 macrophages (M0-exo and M2-exo) were extracted and characterized using transmission electron microscopy, nanoparticle tracking, and Western blotting. Human laryngeal cancer cells (AMC-HN-8) were divided into M0-exo and M2-exo groups, and the effects on cell proliferation were assessed using the CCK-8 assay and cell cloning formation assay. The impact on the motility of monolayer cells was evaluated using the cell scratch assay, while the 3D cell motility was assessed using the Transwell assay. The effect of M2-exo on the epithelial-mesenchymal transition (EMT) process of laryngeal cancer cells, and consequently on their migration and invasion capacity, was validated by Western blotting.
ResultsBioinformatics analysis revealed a significant enrichment of macrophages in head and neck squamous cell carcinoma. The composition of immune cells within the tumor showed a higher expression proportion of M2 TAMs. Cultured M2 TAMs expressed characteristic cell surface markers. M2-exo exhibited the structural and biological features of exosomes. Compared to the M0-exo group, the M2-exo group showed significantly increased proliferation, migration, and invasion capacities of AMC-HN-8 cells, with statistically significant data.
ConclusionM2 TAM exosomes can promote the proliferation, migration, and invasion capacities of laryngeal cancer cells.
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喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤，其中超过95%的喉癌为喉鳞状细胞癌[1-2]。尽管目前手术治疗、同步放化疗等治疗方式提高了喉癌患者的生存质量，但因喉癌本身具有易复发和淋巴结转移的特性，其5年生存率在现有的治疗条件下改善并不明显，仍是头颈部恶性肿瘤中预后较差的肿瘤之一[3-6]。
恶性肿瘤的发生和进展不仅与肿瘤细胞本身的恶性生物学行为有关，同时还会受肿瘤微环境的调控。外泌体是肿瘤微环境中的重要组成部分，肿瘤微环境中的肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞等都可分泌外泌体，进而参与肿瘤细胞间的通讯，这与肿瘤发生发展和组织损伤修复息息相关。在所有的免疫细胞中，肿瘤相关巨噬细胞是最重要的免疫细胞之一，按其表型、分泌的细胞因子可分为经典活化的M1型和选择活化的M2型[7-8]。在肿瘤微环境中，早期巨噬细胞主要以M1型为主，起到抗炎、杀伤肿瘤细胞的作用，伴随着肿瘤的不断进展，肿瘤相关巨噬细胞逐渐转变为免疫抑制为主的M2型，有利于肿瘤的进展，促进肿瘤细胞的免疫逃逸[9-10]。本研究提取M2型巨噬细胞分泌的外泌体，探讨其对喉癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响，旨在为将来喉癌的诊断标志研究及治疗靶点遴选提供新的思路。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
人外周血的单核细胞系THP-1购自武汉普诺赛公司，IL-4、佛波酯购自MedChemExpress公司，RIPA、BCA蛋白定量试剂盒购自索莱宝公司，实时荧光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)试剂盒购自诺贝莱公司，HSP70、IL-10、Arg-1、β-actin、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin一抗、山羊抗兔Ig-G二抗购自Abcam公司，外泌体提取试剂盒、外泌体专用无血清培养基购自宇玫博公司，基底膜基质胶购自康宁公司，CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所。
1.2 生物信息学分析头颈鳞状细胞癌中肿瘤细胞富集情况
下载TCIA数据库与CancerSEA数据库中头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)数据集，使用Cibersort软件对肿瘤患者的免疫细胞组分进行分析。
1.3 细胞培养与分组
人外周血单核细胞株THP-1，采用RPMI 1640，加入10%胎牛血清 + 1%青霉素/链霉素，于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养。将THP-1用RPMI 1640重悬，再添加佛波酯(100 ng/mL)，诱导分化48 h后成为M0型巨噬细胞(未激活的巨噬细胞)，将成熟的M0型巨噬细胞用胰酶消化，重新铺板，后加入IL-4和IL-13 (20 ng/mL)，诱导48 h后成为M2型巨噬细胞。人喉癌细胞AMC-HN-8培养于DMEM培养基 + 10% FBS + 1%双抗中，分为M0-exo组和M2-exo组。
1.4 M2巨噬细胞相关标志物的鉴定
RT-qPCR检测M2巨噬细胞表面标志物和特异性细胞因子水平(Arg-1、CCL-18、CD206、CD-163)，Trizol法提取细胞RNA，使用RT-qPCR试剂盒进行RT-qPCR，以GAPDH为内参，引物序列见表1。
表 1 引物序列Table 1. Primer Sequence目的基因 引物序列(5’-3’) GAPDH F：CCATGGGGAAGGTGAAGGTC
R：GAAGGGGTCATTGATGGCAACIL-10 F：TCTCCGAGATGCCTTCAGCAGA
R：TCAGACAAGGCTTGGCAACCCACCL-18 F：GTTGACTATTCTGAAACCAGCCC
R：GTCGCTGATGTATTTCTGGACCCCD206 F：AGCCAACACCAGCTCCTCAAGA
R：CAAAACGCTCGCGCATTGTCCACD163 F：CCAGAAGGAACTTGTAGCCACAG
R：CAGGCACCAAGCGTTTTGAGCTWestern blot检测M2型巨噬细胞的标志蛋白表达(IL-10、Arg-1)，RIPA组织/细胞快速裂解液提取蛋白，用BCA试剂盒进行蛋白定量，进行SDS丙烯酰胺凝胶电泳，半干转印且进行封闭后，将PVDF膜与IL-10、Arg-1、β-actin一抗4℃孵育过夜，之后将PVDF膜与山羊抗兔Ig-G室温孵育1 h，曝光显影后用ImageJ图像处理软件半定量分析条带。
1.5 外泌体的提取与鉴定
诱导成功的M0和M2型巨噬细胞用外泌体专用无血清培养基饥饿处理48 h后收集上清液，向除去杂质的上清添加试剂盒中的外泌体浓缩溶液(ECS试剂)，5 mL ESC试剂/200 mL上清液。混匀后4℃静置2 h。4℃下10 000 g离心60 min，除上清，留沉淀，100 µL PBS重悬，4℃下再次12 000 g离心2min，去沉淀，留上清。将其放入试剂盒中的Exosomoe Purafication Filter (EPF柱)上室中，4℃下3 000 g离心10 min，取出EPF柱管底的液体，此时的液体为外泌体颗粒富集的纯化液，将纯化好的TAM-exo、M0-exo外泌体放置于-80℃的条件进行保存，便于后续实验使用。使用2%多聚甲醛和1%戊二醛固定外泌体于载样铜网上，将其负染色处理后用透射电镜观察外泌体形态；运用纳米颗粒追踪分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)显示外泌体在PBS溶液状态下的直径分布范围，Western blot检测外泌体标志蛋白HSP70。
1.6 克隆形成实验检测细胞的增殖能力
取100 µL消化好的细胞，以1 × 104/mL的细胞浓度种植于6孔板中，每孔加入2 mL无双抗DMEM培养基培养24 h，使细胞贴壁后弃去旧培养基，M2-exo用培养基稀释为30 µg/mL用于实验组，将同样浓度的M0-exo用于对照组，培养14 d，隔天换液，每个克隆中细胞数大于50时终止培养，4%多聚甲醛固定，Giemsa染液染色后拍照。
1.7 CCK-8实验检测细胞的增殖能力
将AMC-HN-8以5 × 103/mL的细胞浓度接种于96孔板上，按1.6节所述配置实验组、对照组外泌体溶液，每孔加入200 µL，每组设置3个复孔，分别于培养后24 h、48 h、72 h进行检测，各孔加入100 µL新DMEM-HG和10 µL CCK-8试剂，37℃反应4 h后，用酶标仪检测各孔细胞在450 nm处的吸光度值。
1.8 划痕实验检测细胞的迁移能力
将AMC-HN-8以5 × 105/mL的细胞浓度接种于6孔板上，按1.6节所述分别培养对照组、实验组24 h，使细胞汇合度＞90%，用200 µL的枪头进行垂直划痕，每孔更换枪头。划痕完毕后用PBS重复洗2 ~ 3次，将悬浮的细胞洗掉，注意避免冲掉贴壁细胞，换用无FBS的基础培养基继续培养，在不同时间点取出进行显微镜观察和拍照，用ImageJ软件对划痕的面积进行测量，计算迁移率=(0 h划痕面积-24 h划痕的面积)/0 h划痕的面积 × 100%。
1.9 Transwell细胞迁移侵袭能力实验
迁移能力：将细胞5 × 105/mL的浓度接种于上室，每室200 µL。吸取500 µL含15% FBS的DMEM培养基加入下室，按1.6节所述分别处理对照组、实验组。在培养箱中培养36 h后取出，弃去培养基，用多聚甲醛常温下固定25 min，PBS冲洗2遍，晶体紫色染料在室温下进行20 min的染色，清洗1次，在显微镜下拍摄照片。
侵袭能力：将基底膜基质胶置于4℃冰箱中过夜并冰浴解冻，用无血清培养基按照说明书将基质胶稀释。24孔板置于冰上，基质胶均匀铺在上室面，将其放入培养箱中30 min，待其凝固后取出，用无血清培养基冲洗掉残留基质胶，其余步骤同迁移能力实验。
1.10 Western blot检测E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白的表达
Western blot检测M2-exo和M0-exo对肿瘤细胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达的影响，内参抗体使用GAPDH，具体步骤同1.4节。
1.11 统计学方法
使用GraphPad Prism 6.01软件对数据进行分析和绘制。每组均为平行组，每组均至少实验3次。所有数据均为正态分布，计量资料以
$\bar x \pm s $ 表示。组间比较采用单因素方差分析或t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 生物信息分析结果
依托TCIA数据库，在19种肿瘤中分析巨噬细胞富集情况，发现头颈鳞癌中巨噬细胞富集明显(图1)；根据单细胞数据库CancerSEA，分析头颈鳞癌中免疫细胞的组成情况，发现M2型巨噬细胞占有较高的表达比例，说明肿瘤相关巨噬细胞在头颈鳞癌中发挥重要功能(图2)。
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图 2 头颈鳞癌中免疫细胞的组成情况Figure 2. Composition of immune cells in head and neck squamous cell carcinoma2.2 M2型巨噬细胞鉴定结果
使用RT-qPCR检测M2巨噬细胞表面标志物和特异性细胞因子表达水平，发现加入IL-4和IL-13组的细胞中IL-10、Arg-1、CCL-18、CD206、CD-163标志物表达水平高于未加IL-4和IL-13组(图3A) (P＜0.01)；Western blot检测M2型巨噬细胞的标志蛋白水平，加入IL-4和IL-13组的细胞提取的蛋白质中IL-10、Arg-1表达高于对照组(图3B)，说明M2型巨噬细胞提取成功。
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图 3 M2型巨噬细胞的鉴定A：RT-qPCR检测M2巨噬细胞表面标志物；B：Western blot检测IL-10、Arg-1蛋白表达。Figure 3. Identification of M2 macrophages2.3 肿瘤相关巨噬细胞外泌体鉴定结果
经透射电镜观察，成功提取的M0和M2型肿瘤相关巨噬细胞外泌体(TAMs-exo)在透射电镜下的形态呈类圆形微囊泡，结构呈双层膜状，直径约为100 nm (图4A)；运用NTA显示TAMs-exo在PBS溶液状态下的直径分布范围，测得TAMs-exo的平均尺寸约为118.7 nm (图4B)；Western blot实验表明提取到的外泌体特异性表达HSP70标志蛋白(图4C)。
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图 4 肿瘤相关巨噬细胞外泌体鉴定(电镜扫描，5 000 × )A：透射电子显微镜观察结果；B：TAMs-exo的粒径分布图；C：HSP70标志蛋白的表达。Figure 4. Identification of tumor-associated macrophage exosomes (SEM, 5 000 × )2.4 肿瘤相关巨噬细胞外泌体促进喉癌细胞增殖
克隆形成实验显示，与M2-exo共培养的AMC-HN-8细胞形成的克隆集落数目高于M0-exo组(图5A)，量化分析表明此差异有统计学意义(P＜0.01) (图5B)；CCK-8实验显示，与M2-exo共培养的AMC-HN-8细胞在24 h、48 h、72 h时OD值升高，差异有统计学意义(P＜0.01) (图5C)。结果表明M2-exo可增加AMC-HN-8细胞的增殖能力(图5)。
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图 5 肿瘤相关巨噬细胞外泌体对喉癌细胞增殖能力的影响A：克隆形成实验；B：克隆形成实验定量分析；C：CCK-8实验验证M2-exo对AMC-HN-8细胞增殖能力的影响。Figure 5. Effect of tumor-associated macrophage exosomes on proliferation of laryngeal carcinoma cells2.5 肿瘤相关巨噬细胞外泌体促进喉癌细胞的迁移和侵袭
在分别用M0-exo、M2-exo共培养的单层汇合AMC-HN-8中间划出一条划痕，通过观察两侧细胞间距来判断细胞的迁移能力。划痕实验表明，与M2-exo共培养的AMC-HN-8细胞的愈合率高于对照组(图6A)，定量分析后表明差异有统计学意义(P＜0.05) (图6B)；Transwell细胞迁移实验和侵袭实验结果显示，M2-exo组迁移和侵袭到下室的细胞数量多于M0-exo组(图6C)，差异有统计学意义(P＜0.01) (图6D)。结果表明M2-exo能够增强喉癌细胞的迁移侵袭能力(图6)。
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图 6 肿瘤相关巨噬细胞外泌体对喉癌细胞迁移、侵袭能力的影响A：划痕实验；B：划痕实验定量分析；C：Transwell细胞迁移侵袭实验；D：Transwell实验定量分析。Figure 6. Effect of tumor-associated macrophage exosomes on migration and invasion of laryngeal carcinoma cells2.6 肿瘤相关巨噬细胞外泌体影响喉癌细胞EMT进程
Western blot实验结果显示，与M2-exo共培养的细胞N-钙黏蛋白和波形蛋白表达水平升高，E-钙黏蛋白表达水平降低(图7A)，定量分析表明差异有统计学意义(P＜0.05) (图7B)，表明M2-exo可以通过调节EMT促进喉癌细胞的迁移和侵袭(图7)。
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图 7 实验检测E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白的表达水平A：Western blot实验；B：Western blot实验定量分析。Figure 7. The expression levels of E-cadherin，N-cadherin and vimentin were detected3. 讨论
喉癌的发生与饮酒、吸烟、病毒感染(人乳头瘤病毒16、18高危型)、环境等因素相关[11]。目前喉癌的诊断手段依赖于电子纤维喉镜、喉部CT、喉部MRI和临床医师的经验。喉癌早期症状隐匿，无法引起自身足够重视，因此有一部分患者在确诊时已是喉癌中晚期。目前喉癌的治疗方式逐渐向手术联合同步放化疗及分子靶向治疗的综合治疗模式转变，但效果仍欠佳。近年来随着大量的国内外实验成果、研究数据以及大型测序数据被上传至公共数据库和云端，我们建立了庞大的生物信息数据库[12]，在此基础上产生的生物信息学迅速蓬勃发展，探究分子水平肿瘤免疫逃逸的机制为肿瘤新靶点和新型治疗药物的开发提供了新思路。本研究中我们依托大型国内外临床数据库，通过生物信息学技术精准地对头颈鳞状细胞癌的单细胞数据库进行分析，发现M2型肿瘤相关巨噬细胞在头颈鳞状细胞癌组织中显著富集，根据既往对喉癌流行病学的调查，我们知道喉癌的常见病理类型为喉鳞状细胞癌；之后我们又对头颈鳞癌中免疫细胞的组成情况进行了分析，发现M2型巨噬细胞占有较高的表达比例，也进一步说明肿瘤相关巨噬细胞在头颈鳞癌中发挥了重要功能，为继续研究喉癌的发生发展提供了新的方向。本研究成功诱导培养了M2型肿瘤相关巨噬细胞，并对其进行了细胞表型的验证。
肿瘤微环境内含有的肿瘤相关巨噬细胞是一种重要的免疫细胞。肿瘤相关巨噬细胞在不同的组织环境中发生特异性分化，主要分化为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞具有抑制肿瘤生长的作用；M2型巨噬细胞具有促进肿瘤发生发展的功能[13-14]。研究表明，肿瘤早期巨噬细胞主要以M1型为主，伴随着肿瘤的不断进展，肿瘤相关巨噬细胞逐渐转变为以免疫抑制为主的M2型。在大部分癌症中，肿瘤组织中的肿瘤相关巨噬细胞数目与患者的预后密切相关[15]。本研究通过体外诱导，将THP-1分化为M2型巨噬细胞，并且收集M2型巨噬细胞所分泌的外泌体，在体外探究M2-exo对喉癌细胞的影响。
早期研究发现外泌体是细胞外囊泡的一种亚型，直径为30 ~ 200 nm。外泌体可由多种细胞分泌，包括免疫细胞、脂肪细胞、干细胞和肿瘤细胞等[16]。外泌体可携带来自细胞的膜质和细胞内物质，介导细胞间生物分子的交换，促进细胞间的信息交流，因此外泌体被认为是细胞间相互传递信息的介质，可以调节各种细胞的生物学功能[17-18]。研究表明，喉癌细胞能够释放外泌体，并且能够将微小RNA运送至外泌体，血清外泌体miR-941可作为喉鳞状细胞癌的致癌标志蛋白[19-20]；Su等[21]发现肿瘤相关巨噬细胞的激活可促进喉癌的淋巴管生成，Guo等[22]发现肿瘤相关巨噬细胞的激活可促进喉癌细胞化疗敏感性。因此，我们合理推测肿瘤相关巨噬细胞分泌的外泌体可促进喉癌的发生发展。
本研究提取了M2型TAMs的外泌体，采用透射电子显微镜对TAMs-exo的形貌进行鉴定、利用纳米颗粒跟踪分析技术对TAMs-exo的粒径和尺寸分布情况进行鉴定，最后用Western blot对TAMs-exo的标志性蛋白HSP70进行鉴定，确定了外泌体的提取成功；随后将提取到的M0和M2外泌体与人喉癌细胞共培养，验证其体外实验表型：首先使用CCK-8实验和克隆形成实验验证其增殖能力，与对照组相比，实验组细胞增殖能力变强，差异有统计学意义(P＜0.01)，这充分说明M2-exo可增加喉癌细胞的增殖能力；划痕实验发现，与对照组相比，实验组的细胞培养皿在显微镜下可看到划痕处有更多爬行细胞；Transwell实验显示M2-exo组迁移和侵袭到下室的细胞数量显著多于M0-exo组，差异有统计学意义(P＜0.01)；这说明M2-exo能够增强喉癌细胞的迁移侵袭能力；EMT指上皮细胞转化为间质细胞的过程，赋予细胞转移、侵袭的能力，对肿瘤的转移起重要作用，在此过程中E-钙黏蛋白是与EMT呈负相关的标志性蛋白，N-钙黏蛋白和波形蛋白是与EMT呈正相关标志性蛋白。使用M2-exo处理的细胞N-钙黏蛋白和波形蛋白表达水平升高，E-钙黏蛋白表达水平降低，这进一步证明M2-exo可以通过提高细胞N-钙黏蛋白和波形蛋白表达水平、降低E-钙黏蛋白表达水平来促进喉癌细胞的迁移和侵袭。通过以上实验我们证实肿瘤相关巨噬细胞分泌的外泌体可以参与癌症进展的过程，如肿瘤增殖、转移、侵袭和免疫调节[23]。此外由于外泌体广泛存在于体液中(包括血液、尿液、唾液、淋巴液)，标本容易获取，且靶基因敏感、诊断特异性强，可为日后的早期诊断、复发检测以及耐药测试提供新的思路。
综上所述，肿瘤相关巨噬细胞外泌体可在体外促进喉癌细胞增殖、迁移和侵袭。目前对于喉癌与肿瘤相关巨噬细胞外泌体关系的研究较少，因此本课题组将继续进行分子层面的探索，进一步研究外泌体所携带的物质及通路，明确其调控机制，为喉癌的诊治提供新的方法。
作者贡献 刘金婧：论文构思与撰写；赵凯：论文修订，监督指导；徐海铭、高歌、黄静宜：审读和修订；刘明波：论文整体指导。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突。
数据共享声明 本论文相关数据可依据合理理由从作者处获取，Email：15204004143@163.com。
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图 2 头颈鳞癌中免疫细胞的组成情况
Figure 2. Composition of immune cells in head and neck squamous cell carcinoma
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图 3 M2型巨噬细胞的鉴定
A：RT-qPCR检测M2巨噬细胞表面标志物；B：Western blot检测IL-10、Arg-1蛋白表达。
Figure 3. Identification of M2 macrophages
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图 4 肿瘤相关巨噬细胞外泌体鉴定(电镜扫描，5 000 × )
A：透射电子显微镜观察结果；B：TAMs-exo的粒径分布图；C：HSP70标志蛋白的表达。
Figure 4. Identification of tumor-associated macrophage exosomes (SEM, 5 000 × )
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图 5 肿瘤相关巨噬细胞外泌体对喉癌细胞增殖能力的影响
A：克隆形成实验；B：克隆形成实验定量分析；C：CCK-8实验验证M2-exo对AMC-HN-8细胞增殖能力的影响。
Figure 5. Effect of tumor-associated macrophage exosomes on proliferation of laryngeal carcinoma cells
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图 6 肿瘤相关巨噬细胞外泌体对喉癌细胞迁移、侵袭能力的影响
A：划痕实验；B：划痕实验定量分析；C：Transwell细胞迁移侵袭实验；D：Transwell实验定量分析。
Figure 6. Effect of tumor-associated macrophage exosomes on migration and invasion of laryngeal carcinoma cells
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图 7 实验检测E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白的表达水平
A：Western blot实验；B：Western blot实验定量分析。
Figure 7. The expression levels of E-cadherin，N-cadherin and vimentin were detected
表 1 引物序列
Table 1 Primer Sequence
目的基因 引物序列(5’-3’) GAPDH F：CCATGGGGAAGGTGAAGGTC
R：GAAGGGGTCATTGATGGCAACIL-10 F：TCTCCGAGATGCCTTCAGCAGA
R：TCAGACAAGGCTTGGCAACCCACCL-18 F：GTTGACTATTCTGAAACCAGCCC
R：GTCGCTGATGTATTTCTGGACCCCD206 F：AGCCAACACCAGCTCCTCAAGA
R：CAAAACGCTCGCGCATTGTCCACD163 F：CCAGAAGGAACTTGTAGCCACAG
R：CAGGCACCAAGCGTTTTGAGCT
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