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摘要:背景
研究表明活化T细胞核因子c4(nuclear factor of activated T-cells，cytoplasmic 4，NFATc4)的激活表达可促进恶性黑色素瘤的发生发展，但NFATc4在黑色素瘤中的靶向分子及其在不同类型黑色素瘤中的表达尚不明确。
目的探讨NFATc4及其靶标MMP2、COX2在黑色素瘤细胞及不同黑色素瘤亚型中的表达水平及其与临床病理特征的关系。
方法建立NFATc4过表达的黑色素瘤细胞系，检测NFATc4的功能及其与MMP2和COX2的表达相关性；利用免疫组织化学法检测皮肤肢端黑色素瘤、皮肤非肢端黑色素瘤、鼻腔黏膜黑色素瘤石蜡组织和色素痣石蜡组织样本中NFATc4、MMP2、COX2的表达情况，并分析NFATc4、MMP2、COX2与不同类型恶性黑色素瘤临床病理特征的关系。免疫组化实验分为对照组 (色素痣组)和实验组(皮肤肢端黑色素瘤组、皮肤非肢端黑色素瘤组、鼻腔黏膜黑色素瘤组)。
结果NFATc4促进黑色素瘤细胞的迁移和侵袭，其表达与MMP2和COX2呈正相关。这3种分子在3种恶性黑色素瘤亚型组织中的表达均高于皮内痣(P＜0.01)；在肢端和黏膜黑色素瘤中的表达均高于非肢端黑色素瘤(P＜0.05)；NFATc4与MMP2、COX2表达水平呈正相关(P＜0.01)。
结论NFATc4可能通过调控MMP2、COX2参与肢端及黏膜黑色素瘤的发生及发展。
Abstract:BackgroundStudies have demonstrated that the activated expression of nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 4 (NFATc4) can promote the progression of malignant melanoma with different subtypes. However, the target molecules of NFATc4 in melanoma and its expression across different types of melanoma remain unclear.
ObjectiveTo investigate the expression levels of NFATc4 and its targets MMP2 and COX2 in melanoma cells and various melanoma subtypes, as well as their correlation with clinicopathologic features.
MethodsMelanoma cell lines with NFATc4 overexpression were established to assess NFATc4 function and its association with MMP2 and COX2 expression. The expressions of NFATc4, MMP2, and COX2 were examined using immunohistochemical methods in 11 cases of cutaneous acral melanomas, 10 cases of cutaneous non-acral melanomas, 15 cases of nasal mucosal melanoma, and 10 cases of pigmentation nevus. The correlation between NFATc4, MMP2, COX2, and clinicopathological features of different types of malignant melanoma was analyzed.
ResultsNFATc4 was found to promote the migration and invasion of melanoma cells, with MMP2 and COX2 expression showing a positive correlation. The expression of these three molecules in the three subtypes of malignant melanoma was significantly higher than that in pigmentation nevus (P ＜ 0.01). Furthermore, the expression levels of melanomas in acral and mucosa were higher than those in non-acral melanomas (P ＜ 0.05), and NFATc4 was positively correlated with the expression levels of MMP2 and COX2 (P < 0.01).
ConclusionThese findings suggest that NFATc4, MMP2, and COX2 may play roles in the initiation and progression of acral and mucosal melanoma. However, further investigation is required to elucidate the specific mechanism of action.
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Keywords:
- melanoma /
- nevus /
- NFATc4 /
- matrix metalloproteinase 2 /
- cyclooxygenase 2
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恶性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)多发于皮肤和黏膜，其中肢端和黏膜黑色素瘤在我国和其他亚洲国家高发[1]。近年来，黑色素瘤的诊疗技术有极大进展，但肢端和黏膜黑色素瘤患者从目前的治疗中获益较少[1]。基因组学及生物学信息学技术的不断发展，为恶性肿瘤等复杂疾病的机制研究提供了有力工具。
本课题组之前对于肢端黑色素瘤的单细胞转录组学研究发现，活性T细胞核因子c4 (nuclear factor of activated T cells，NFATc4)在肢端黑色素瘤细胞中高表达，提示该因子可能在肢端黑色素瘤的发生发展中起关键作用[2]。文献报道NFATc4在肿瘤中的高表达通常与一些肿瘤的侵袭、转移、耐药性以及患者预后不良相关，即NFATc4高表达的肿瘤患者往往预后较差[3-4]，NFATc4可能是一种重要的肿瘤标志物，可以作为评估肿瘤恶性程度和预后的重要参考指标。与其他NFAT蛋白相比，NFATc4的研究相对较少。环氧化酶2(cyclooxygenase 2，COX2)是一种诱导酶，在炎症中参与前列腺素和血栓素的产生，可能参与恶性上皮肿瘤的发生发展[5]；基质金属蛋白酶(matrix metallopeptidase 2，MMP2)是MMP家族中的重要成员之一，在恶性肿瘤的发生及转移中起重要作用。在膀胱癌细胞中，抑制NFAT可导致MMP2的表达活性降低，细胞凋亡增加[6]。既往研究表明NFATc4、COX2、MMP2在黑色素瘤中均表达上调[7-8]。NFATc4、MMP2、COX2在不同类型恶性黑色素瘤中的表达情况尚未见报道。
本研究拟在肢端黑色素瘤组织(acral melanoma，AM)、非肢端黑色素瘤组织(non-acral melanomas，NAM)、黏膜黑色素瘤组织(sinonasal mucosal melanoma，SNMM)及人源原位黑色素瘤细胞系A375中检测MMP2、COX2及其转录调节因子NFATc4的表达水平，并初步探讨其作用机制和临床意义。
1. 材料与方法
1.1 细胞与试剂
人源原位黑色素瘤细胞系A375购自美国模式培养物保藏所(ATCC)，DMEM培养基(Invitrogen公司，C11965500BT)；胎牛血清(Gibco公司，19042772)；链霉素双抗(Life Technologies公司，15140122)，基质胶(BD公司，356234)，鼠抗人NFATc4单抗(Santa Cruz Biotechnology，sc-271597)、鼠抗人MMP-2单抗(Abcam，ab86607)、兔抗人COX-2单抗(Abcam，ab179800)、免疫组化染色试剂盒(PV-9001/PV9002)、EDTA修复液pH 8.0 (ZLI-9067)、DAB kit (ZLI-9018)、中性树胶(ZLI-9555)均购自北京中杉金桥公司。逆转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (RR047A) 购自日本Takara公司。KAPA SYBR FAST Universal qPCR Kit通用型(KK4601)购自美国KAPA公司。
1.2 临床标本
收集并筛选解放军总医院2013年1月— 2023年1月黑色素瘤患者的石蜡组织标本，皮肤肢端黑色素瘤组织11例、皮肤非肢端黑色素瘤组织10例、鼻腔黏膜黑色素瘤组织15例、皮内痣组织10例。本研究经解放军总医院医学伦理委员会审查备案，审批号：S2021-626-01。所有患者均签署知情同意书。患者临床资料见表1。
表 1 NFATc4、MMP2、COX2在不同类型黑色素瘤中表达强度与不同临床特点之间的关系(n=36，$\bar x \pm s $ )Table 1. NFATc4, MMP2 and COX2 expression intensity in different types of melanoma and their relationship between different clinical features (n=36,$\bar x \pm s $ )指标 例数/例 NFATc4表
达强度MMP2表
达强度COX2表
达强度年龄 ≤60岁 15 2.73 ± 3.26 7.44 ± 2.87 1.27 ± 1.99 ＞60岁 21 4.22 ± 2.90 8.30 ± 3.18 1.79 ± 1.66 t值 -1.444 -0.830 -0.865 P值 0.158 0.412 0.393 性别 男 16 3.58 ± 3.77 7.52 ± 3.41 1.40 ± 1.73 女 20 3.62 ± 2.54 8.28 ± 2.75 1.72 ± 1.88 t值 -0.033 -0.743 -0.526 P值 0.974 0.463 0.602 不同类型 肢端 11 2.48 ± 0.05 7.30 ± 0.14 1.67 ± 0.05 非肢端 10 1.75 ± 0.05 6.54 ± 0.18 1.33 ± 0.05 黏膜 15 5.55 ± 0.11 8.91 ± 0.17 1.60 ± 0.07 F值 2178 166.5 28.23 P值 ＜ 0.0001 ＜ 0.0001 0.0009 有无色素 有 16 4.10 ± 3.39 8.17 ± 3.55 2.15 ± 2.14 无 20 3.20 ± 2.87 7.77 ± 2.65 1.12 ± 1.36 t值 0.850 0.387 1.758 P值 0.402 0.701 0.088 1.3 细胞培养
人源原位黑色素瘤细胞系A375使用含有10%胎牛血清和1%双抗(青霉素和链霉素)的DMEM培养基置于37℃、5% CO2的培养箱中培养，每隔2 ~ 3 d传代换液。
1.4 免疫组化染色
实验分为对照组(色素痣组织)和实验组(皮肤肢端黑色素瘤组织、皮肤非肢端黑色素瘤组织、鼻腔黏膜黑色素瘤组织)，切取厚约5 μm的石蜡组织，经脱蜡、水化、抗原修复(加入8% EDTA修复液高压修复)、脱色素(分别加入4%多聚甲醛、0.1%高锰酸钾溶、1%草酸溶液)，直至玻片无明显黑色或褐色，加入3%过氧化氢室温孵育10 min；PBS 溶液洗3 min，共3次；再加入0.05% Triton-100孵育15 min，PBS溶液洗3 min，共3次，加入5% BSA封闭1 h，后加入适当稀释的一抗，在4℃冰箱过夜 (时间≥12 h)，PBS溶液代替一抗作为阴性对照，室温复温30 min。PBS 溶液洗3 min，共3次；加入适当稀释的二抗，室温孵育20 min；PBS溶液洗3 min，共3次。显色：用蒸馏水稀释DAB染色液，配置成1∶50的工作液，滴加显色(30 s ~ 10 min)，观察载玻片变为棕黄色，蒸馏水洗5 min；复染：苏木素1 min，盐酸乙醇1 s，氨水反蓝1 s，蒸馏水洗5 min，共3次；脱水、透明：乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各3 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5 min；自动封片机封片，显微镜观察染色情况。
1.5 免疫组化结果判定
通过人工计数法确定组织细胞中阳性细胞的染色强度及阳性细胞百分比来进行判读[9]。无染色为0分，淡黄色(弱染色)为1分，棕黄色(中染色)为2分，棕褐色(强染色)为3分；阳性细胞所占百分比≤10%为1分，11% ~ 50%为2分，51% ~ 75%为3分，＞75%为4分。免疫组化结果由两名皮肤科病理医师采用双盲法独立阅片，每张切片随机选取5个高倍视野(400× )，每个高倍视野计数50个肿瘤细胞、痣细胞或普通细胞，观察阳性细胞染色强度，计数阳性细胞百分比，表达强度为所计的分数相乘得出的积分，再取2个样本得分的平均值。＜3分为阴性，≥3分为阳性。
1.6 慢病毒感染人源原位黑色素瘤细胞A375
A375细胞以1 × 105/孔接种于12孔板中，用含10% FBS的DMEM完全培养基培养过夜。将40 μL NFATc4或对照Phage重组慢病毒浓缩液加入培养基中，轻轻混匀，并加入终浓度为8 μg/mL的Polybrene提高感染效率。同时建立对照组。感染24 h后换回常规培养基继续培养，72 h后于荧光倒置显微镜下观察转染效率，用流式细胞分选术分选出含GFP荧光的细胞，认定为稳定表达NFATc4的细胞株。
1.7 实时荧光定量 PCR检测A375细胞中MMP2及COX2表达
使用Trizol裂解细胞(A375-NFATc4，A375-phage)，加入氯仿和异丙醇提取细胞总RNA并进行浓度测定和质量检测，经反转录合成cDNA。采用CFX96实时荧光定量PCR检测系统进行基因表达分析(所有基因的引物序列见表2)。
表 2 引物序列Table 2. Primer sequence基因 引物序列 NFATc4 F：5’-ACCCTACAGATGTTCATCGGC-3’
R：5’-ATTCCCGCGCAGTCAATGT-3’MMP-2 F：5’-CGTCGCCCATCATCAAGTTC-3’
R：5’-GTCTGGGGCAGTCCAAAGAA-3’COX-2 F：5’-GCTGTCCCCACATTAGGCTT-3’
R：5’-GCTGTCCCCACATTAGGCTT-3’Actin F：5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’
R：5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’1.8 Transwell 迁移与侵袭实验
用预冷的无血清基础培养基将基质胶配制成相应浓度的工作胶(6∶1)，每个Transwell小室孔加入100 μL工作胶(迁移实验为常规操作)，收集消化好的A375-phage和A375-NFATc4细胞，用无血清DMEM基础培养基重悬，以2 × 104/孔的细胞密度接种到Transwell小室的上腔室中，下腔室中加入含有20%血清的DMEM完全培养基。培养24 h后，弃去旧培养基，4%多聚甲醛室温固定15 min后，吸弃，PBS缓冲液清洗1 ~ 2次，室温下用0.1%结晶紫染液对迁移侵袭细胞瞬时染色，PBS缓冲液清洗1 ~ 2次，棉签轻轻擦去上腔室膜上的细胞并用倒置显微镜观察迁移到上腔膜下的细胞，拍照记录。
1.9 统计学分析
使用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8软件处理数据。计量资料均以
$\bar x \pm s $ 表示，两组间均数的比较采用t检验，多组间均数的比较采用方差分析，各变量表达强度的相关性采用Spearman相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 NFATc4在肢端黑色素瘤组织中的表达
对临床样本进行免疫组化染色发现，11例肢端黑色素瘤和15例黏膜黑色素瘤组织中NFATc4呈强阳性表达，细胞核与细胞质均有分布；而在10例非肢端黑色素瘤中呈散在阳性分布；色素痣组织中几乎未见阳性(P＜0.05)。见图1A、图1B、表1。
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图 1 NFATc4在肢端黑色素瘤中高表达NFATc4在肢端黑色素瘤组织、非肢端黑色素瘤组织、黏膜黑色素瘤组织、色素痣组织的免疫组化染色结果(A，400 × )及评判得分(B)。Figure 1. NFATc4 was highly expressed in acral melanomas2.2 NFATc4稳定表达的黑色素瘤细胞株的建立及NFATc4对黑色素瘤细胞迁移与侵袭能力的作用
为研究NFATc4与恶性黑色素瘤发生发展的相关性，本研究采用慢病毒感染的方法在黑色素瘤细胞A375中构建NFATc4稳定过表达细胞株并进行转录水平和蛋白质水平的鉴定。结果证实A375 NFATc4稳定过表达细胞株构建成功，见图2A和图2B。Transwell迁移与侵袭实验结果显示，相比对照组，NFATc4过表达组细胞迁移与侵袭能力增加(P＜0.05)，见图2C和图2D。
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图 2 NFATc4过表达细胞株建立验证及NFATc4对黑色素瘤细胞迁移与侵袭的影响A：A375稳定株 NFATc4的mRNA表达水平；B：A375稳定株 NFATc4的蛋白表达水平；C：Transwell小室迁移实验检测NFATc4对A375细胞迁移能力的影响(400 × )；D：Transwell小室侵袭实验检测NFATc4对A375细胞侵袭能力的影响(400 × )。Figure 2. Verification of the establishment of NFATc4 overexpression A375 cell, the effect of NFATc4 on melanoma cell migration and invasion2.3 NFATc4在恶性黑色素瘤细胞中的作用及与MMP2、COX2的表达相关性
利用qPCR技术检测A375细胞中NFATc4、MMP2和COX2的表达水平。结果显示，过表达NFATc4后A375细胞中MMP2和COX2的表达水平均较对照组上升(图3A：P＜0.01；图3B：P＜0.05)。
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图 3 过表达NFATc4恶性黑色素瘤细胞A375与对照组MMP2、COX2的表达A：MMP2在过表达NFATc4的A375稳定株中的mRNA表达水平； B：COX2在过表达NFATc4的A375稳定株中的mRNA表达水平。Figure 3. Expressions levels of MMP2 and COX2 in NFATc4 overexpression A375 malignant melanoma cells versus control2.4 MMP2和COX2在肢端黑色素瘤组织中的表达
利用免疫组化染色法研究肢端黑色素瘤、黏膜黑色素瘤、非肢端黑色素瘤和色素痣组织中MMP2 、COX2的表达情况。结果显示，在肢端黑色素瘤组织(n=11)及黏膜黑色素瘤组织(n=15)中，MMP2强阳性信号大量分布于细胞质和细胞膜，呈棕黄色；在非肢端黑色素瘤组织(n=10)中可见散在分布的阳性信号，在痣细胞组织中几乎无表达(P＜0.05)，见图4A和图4B。COX2在肢端黑色素瘤组织和黏膜黑色素瘤组织中呈阳性表达，在非肢端黑色素瘤组织中呈弱阳性表达，定位于细胞质，呈淡黄色；在痣细胞组织中无明显表达，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见图4C和图4D。这说明MMP2和COX2在恶性黑色素瘤中的表达高于色素痣，在肢端黑色素瘤和黏膜黑色素瘤中的表达高于非肢端黑色素瘤，见表1。
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图 4 MMP2及COX2在肢端黑色素瘤细胞中高表达A、B：MMP2在肢端黑色素瘤组织、非肢端黑色素瘤组织、黏膜黑色素瘤组织、色素痣组织免疫组化染色结果及评判得分(400 × )；C、D：COX2在肢端黑色素瘤组织组织 、非肢端黑色素瘤组织、黏膜黑色素瘤组织、色素痣组织免疫组化染色结果及评判得分(400 × )。Figure 4. MMP2 and COX2 are highly expressed in acral melanoma cells2.5 NFATc4、MMP2 、COX2与3种黑色素瘤亚型的临床特征相关性
恶性黑色素瘤中，NFATc4的表达与黑色素瘤的亚型有关，在肢端黑色素瘤和黏膜黑色素瘤中的表达强于非肢端黑色素瘤(P＜0.05)，与患者的性别、年龄、皮损处有无色素沉着等因素无显著相关性(P＞0.05)；MMP2和COX2同样在肢端和黏膜黑色素瘤中的表达强于非肢端黑色素瘤(P＜0.05)，与患者的性别、年龄、发病部位、皮损处有无色素等因素无显著相关性 (P＞0.05)，见表1。
Sperman相关性分析结果显示，NFATc4与MMP2在MM组织中的表达强度呈正相关(r=0.797，P＜0.001)，见图5A；NFATc4与COX2在MM组织中的表达强度呈正相关(r=0.508，P=0.002)，见图5B。
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图 5 NFATc4、MMP2、COX2在恶性黑色素瘤组织中表达强度的相关性分析A ：在黑色素瘤组织中NFATc4与MMP2的表达强度呈正相关； B ：在黑色素瘤组织中NFATc4与COX2的表达强度呈正相关。Figure 5. Correlation analysis of expression intensity of NFATc4, MMP2 and COX2 in malignant melanoma tissues3. 讨论
肢端和黏膜黑色素瘤有许多共同的临床病理特征，包括侵袭性表型、广泛的放射状生长阶段、显著的雀斑样生长以及预后不良，但缺乏其他黑色素瘤亚型中常见的驱动突变。尽管近年来黑色素瘤的治疗方面取得了一些进展，但这些方案和方法对肢端和黏膜黑色素瘤患者的疗效有限[1]，因此探索不同类型黑色素瘤的发病机制对肢端和黏膜黑色素瘤患者的生存结果至关重要。
NFATc4为NFAT家族的转录因子之一，受到Ca2+ /钙调磷酸酶信号激活。越来越多的研究表明，异常激活的NFATc4参与并调控了多种肿瘤，包括但不限于肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、胶质瘤、急性髓细胞白血病的发生、增殖、侵袭和转移[3,10-11]。与其他NFAT蛋白相比，NFATc4在黑色素瘤中的表达和功能目前仅有1篇报道——Xiao等[8]利用免疫荧光等方法检测到NFATc4在皮肤鳞状细胞癌、基底细胞癌、黑色素瘤等皮肤癌组织中高表达，在正常皮肤及色素痣组织中低表达，NFATc4抑制剂在黑色素瘤细胞中具有抗增殖、抗转移的作用。本研究发现NFATc4在肢端及黏膜黑色素瘤中的阳性表达率高于非肢端黑色素瘤，因此NFATc4在侵袭性更强及预后更差的黑色素瘤类型中表达更高。上述结果都提示NFATc4在黑色素瘤中高表达，其表达程度与恶性程度具有相关性。NFATc4有望成为肢端和黏膜黑色素瘤新的诊断和治疗靶点。
Transwell迁移与侵袭实验表明，NFATc4的过表达显著增强了黑色素瘤细胞系A375的迁移和侵袭能力，提示NFATc4可能通过促进肿瘤细胞的迁移和侵袭来发挥其生物学功能。本研究中关注的另外两个分子MMP2和COX2都与肿瘤转移相关，MMPs在肺癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌和前列腺癌等恶性肿瘤中高表达，且与肿瘤的转移和不良预后密切相关[12-16]。MMP2不仅可以降解细胞外基质促进肿瘤细胞扩散，还能通过新生毛细血管促进肿瘤侵袭与转移[17-18]；COX2在肺癌[19]、胃肠癌[20]和乳腺癌[21]中高度表达并促进了肿瘤的发生发展。在小鼠和人类黑色素瘤模型中也能检测到高水平的COX2异构体[22]。COX2在肿瘤细胞中的功能可能与刺激血管生成、抑制凋亡、增加细胞增殖、细胞侵袭性、免疫抑制和诱变剂的产生有关[23]。其中，COX2对前列腺素E2 (PGE2)具有重要的介导作用，而PGE2已被发现可通过干扰恶性黑色素瘤的侵袭和进展，在癌变过程中发挥关键作用[24]。本研究中，MMP2和COX2在肢端及黏膜黑色素瘤等侵袭性更强的亚型中的表达强于非肢端黑色素瘤，并与NFATc4的表达强度呈正相关。为进一步验证，设计体外实验，在过表达NFATc4的A375细胞中，MMP2和COX2表达量也随之增加。这些结果表明NFATc4可能通过调控MMP2和COX2促进肿瘤细胞的侵袭与迁移功能，从而发挥其生物学作用。
本研究通过实验证明，NFATc4、MMP2、COX2在恶性黑色素瘤中高表达。过表达NFATc4可显著提高MM细胞迁移与侵袭能力；MMP2和COX2的表达也随着NFATc4过表达而升高。为了深入阐明NFATc4在恶性黑色素瘤中的分子作用机制，本课题组未来将结合已有的肢端黑色素瘤的单细胞转录组数据和本研究中建立的A375-NFATc4稳定表达细胞模型，通过生信技术分析NFATc4在恶性黑色素瘤细胞中的上、下游分子调控通路，并在细胞水平和荷瘤小鼠模型中完成验证。
作者贡献 饶玮：细胞与分子学实验，文章撰写，数据分析；赵华：实验设计与指导；冯靖懿、王祎琳：文章修改与校正；杜治民 、马冠毅、苏清：文献收集和整理。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突。
数据共享声明 本论文相关数据可依据合理理由从作者处获取，Email：rw752307191@163.com。
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图 1 NFATc4在肢端黑色素瘤中高表达
NFATc4在肢端黑色素瘤组织、非肢端黑色素瘤组织、黏膜黑色素瘤组织、色素痣组织的免疫组化染色结果(A，400 × )及评判得分(B)。
Figure 1. NFATc4 was highly expressed in acral melanomas
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图 2 NFATc4过表达细胞株建立验证及NFATc4对黑色素瘤细胞迁移与侵袭的影响
A：A375稳定株 NFATc4的mRNA表达水平；B：A375稳定株 NFATc4的蛋白表达水平；C：Transwell小室迁移实验检测NFATc4对A375细胞迁移能力的影响(400 × )；D：Transwell小室侵袭实验检测NFATc4对A375细胞侵袭能力的影响(400 × )。
Figure 2. Verification of the establishment of NFATc4 overexpression A375 cell, the effect of NFATc4 on melanoma cell migration and invasion
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图 3 过表达NFATc4恶性黑色素瘤细胞A375与对照组MMP2、COX2的表达
A：MMP2在过表达NFATc4的A375稳定株中的mRNA表达水平； B：COX2在过表达NFATc4的A375稳定株中的mRNA表达水平。
Figure 3. Expressions levels of MMP2 and COX2 in NFATc4 overexpression A375 malignant melanoma cells versus control
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图 4 MMP2及COX2在肢端黑色素瘤细胞中高表达
A、B：MMP2在肢端黑色素瘤组织、非肢端黑色素瘤组织、黏膜黑色素瘤组织、色素痣组织免疫组化染色结果及评判得分(400 × )；C、D：COX2在肢端黑色素瘤组织组织 、非肢端黑色素瘤组织、黏膜黑色素瘤组织、色素痣组织免疫组化染色结果及评判得分(400 × )。
Figure 4. MMP2 and COX2 are highly expressed in acral melanoma cells
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图 5 NFATc4、MMP2、COX2在恶性黑色素瘤组织中表达强度的相关性分析
A ：在黑色素瘤组织中NFATc4与MMP2的表达强度呈正相关； B ：在黑色素瘤组织中NFATc4与COX2的表达强度呈正相关。
Figure 5. Correlation analysis of expression intensity of NFATc4, MMP2 and COX2 in malignant melanoma tissues
表 1 NFATc4、MMP2、COX2在不同类型黑色素瘤中表达强度与不同临床特点之间的关系(n=36，
$\bar x \pm s $ )Table 1 NFATc4, MMP2 and COX2 expression intensity in different types of melanoma and their relationship between different clinical features (n=36,
$\bar x \pm s $ )指标 例数/例 NFATc4表
达强度MMP2表
达强度COX2表
达强度年龄 ≤60岁 15 2.73 ± 3.26 7.44 ± 2.87 1.27 ± 1.99 ＞60岁 21 4.22 ± 2.90 8.30 ± 3.18 1.79 ± 1.66 t值 -1.444 -0.830 -0.865 P值 0.158 0.412 0.393 性别 男 16 3.58 ± 3.77 7.52 ± 3.41 1.40 ± 1.73 女 20 3.62 ± 2.54 8.28 ± 2.75 1.72 ± 1.88 t值 -0.033 -0.743 -0.526 P值 0.974 0.463 0.602 不同类型 肢端 11 2.48 ± 0.05 7.30 ± 0.14 1.67 ± 0.05 非肢端 10 1.75 ± 0.05 6.54 ± 0.18 1.33 ± 0.05 黏膜 15 5.55 ± 0.11 8.91 ± 0.17 1.60 ± 0.07 F值 2178 166.5 28.23 P值 ＜ 0.0001 ＜ 0.0001 0.0009 有无色素 有 16 4.10 ± 3.39 8.17 ± 3.55 2.15 ± 2.14 无 20 3.20 ± 2.87 7.77 ± 2.65 1.12 ± 1.36 t值 0.850 0.387 1.758 P值 0.402 0.701 0.088 
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表 2 引物序列
Table 2 Primer sequence
基因 引物序列 NFATc4 F：5’-ACCCTACAGATGTTCATCGGC-3’
R：5’-ATTCCCGCGCAGTCAATGT-3’MMP-2 F：5’-CGTCGCCCATCATCAAGTTC-3’
R：5’-GTCTGGGGCAGTCCAAAGAA-3’COX-2 F：5’-GCTGTCCCCACATTAGGCTT-3’
R：5’-GCTGTCCCCACATTAGGCTT-3’Actin F：5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’
R：5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’
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